Лиофилизированная кПЦР против ПЦР с жидкими реагентами и LAMP для скрининга патогенов креветок на ферме

Почему креветок проверяют, а не лечат

У ракообразных есть только врожденная иммунная система: ни антител, ни иммунной памяти, ни вакцины. Пруд, переживший в прошлом году белую пятнистость, в этом году не охраняется. Таким образом, контроль означает исключение инфицированных постличинок, производителей, живых кормов и носителей, а также раннее обнаружение во время сбора урожая, чтобы положительный результат вызвал частичный сбор урожая или смену управления до того, как пруд обрушится. Каждое из этих решений представляет собой молекулярный тест, и большинство из них приходится принимать там, где нет лаборатории.

Сравнение четырех молекулярных методов

Традиционная и вложенная ПЦР. Историческая справка по WSSV, IHHNV и EHP. Два раунда амплификации и гель дают очень высокую чувствительность, но второй раунд в открытой пробирке является классическим источником загрязнения ампликона, анализ занимает три-четыре часа, результат - полоса, считываемая на глаз, и для этого требуется соответствующая лаборатория с отдельными помещениями.

ПЦР в реальном времени (количественная). Обнаружение флуоресценции в закрытой пробирке, результат примерно через час и пороговое значение цикла, которое отражает нагрузку патогенов. Для креветок нагрузка имеет значение: слабый положительный результат в пруду для выращивания и сильный положительный результат в партии постличинок требуют разных действий. WOAH называет ПЦР в реальном времени наряду с вложенной ПЦР рекомендуемым методом для выявления основных вирусов креветок.

LAMP и другие изотермические химические процессы. Быстрый, простой нагрев, визуальное считывание. Привлекателен для использования в полевых условиях, но разработка праймера для LAMP с шестью праймерами сложна, мультиплексирование ограничено, а очень высокий выход ампликонов делает перенос загрязнения постоянным риском в условиях фермы. Его лучше всего использовать в качестве одноцелевого экрана со строгим физическим разделением ступеней.

Лиофилизированная (сублимационно высушенная) ПЦР в реальном времени. Та же химия реакции, что и в кПЦР на жидких реагентах, только мастер-микс, праймеры и зонд высушены в пробирке. Оператор добавляет экстракт и воду, и пробирка сразу помещается в анализатор. Так за один шаг исключаются пипетирование ферментов и большая часть возможностей для контаминации.

Что меняет лиофилизация

Холодовая цепь. Жидкий мастер-микс должен оставаться замороженным на всем пути от завода до лабораторного стола и выдерживает лишь несколько циклов замораживания–оттаивания. Ферма в трех часах езды от ближайшей морозильной камеры или инкубаторий, где электричество отключается каждую неделю, не сможет обеспечить его хранение. Для лиофилизированного набора сверьте температуру хранения и срок годности, указанные на этикетке и в инструкции по применению, с условиями на объекте; инструкцию по применению мы направляем вместе с коммерческим предложением.

Практические шаги. При использовании влажных реагентов оператор пипеткой вносит в каждую пробирку буфер, фермент, праймеры, зонд и матрицу; каждый перевод представляет собой возможность заражения и требует обучения. К высушенной трубке добавляются две добавки: экстракт и вода. Вот почему техник инкубатория, прошедший однодневное обучение, надежно управляет им.

Последовательность. В каждой пробирке партии содержится одна и та же масса реагента; нет различий в пипетировании между сериями или операторами, что делает значения Ct сопоставимыми от недели к неделе в одном и том же пруду.

Чувствительность. Правильно составленный лиофилизированный химический состав соответствует его влажному эквиваленту; лиофилизация защищает фермент, а не разрушает его. Пределы обнаружения для линии аквакультуры указаны для каждого набора на страницах продукта.

План выборки, который что-то значит

Отрицательный тест десяти креветок мало что говорит о пруде в миллион. В таблицах выборки WOAH указано количество животных, необходимое для обнаружения возбудителя при заданной распространенности с 95-процентной достоверностью в большой популяции: 150 животных для 2-процентной распространенности, 60 для 5 процентов, 30 для 10 процентов. Пост-личинки объединяются, поэтому сертификационное испытание партии обычно представляет собой объединенную выборку из 150 животных, иногда разделенную на несколько групп, чтобы можно было локализовать положительный результат.

Практическим минимумом во время выращивания является сбор от 10 до 20 креветок из лотка для кормления каждые две-три недели, а также осадок из зоны кормления между посевами. Маточное стадо проверяется на нелетальный результат по фекалиям или биопсии плеопод; Живые корма, такие как полихеты, тестируются партиями перед поступлением в инкубаторий.

Рабочий процесс фермы: от образца к решению

Отбор проб: постличинки, ткани, жабры, гепатопанкреас, фекалии, корм или вода — у пруда или в инкубатории. Подготовка: буфер без экстракции для тканей — за пять минут, или набор на магнитных частицах для воды, донных отложений и серий проб. Запуск: лиофилизированную пробирку регидратируют экстрактом и загружают в компактный анализатор; при использовании буфера без экстракции и наборов на 24 теста результат и его значение Ct появляются на экране примерно через 50 минут после отбора проб. Решение: забраковать или принять партию, прекратить или продолжить кормление живым кормом, провести досрочный облов или завершить цикл. Вся цепочка замыкается за полдня прямо на месте — и именно в этом разница между работающей программой скрининга и программой, существующей лишь на бумаге.

Стоимость, в единственных единицах, которые имеют значение

Тест стоит несколько долларов реагента и час времени техника. Потеря урожая приводит к расходам на поголовье, корм, электроэнергию и сезон. Инкубаторий, который сертифицирует каждую партию с помощью количественной ПЦР, продает постличинки с наценкой и удерживает своих клиентов; ферма, которая проводит проверку при зарыблении и каждые две недели превращает вспышку WSSV из полной потери в частичный ранний урожай. Сравнение приведенных выше методов реально, но именно сравнение тестирования и отсутствия тестирования решает, сохранится ли ферма в следующем году.

Подготовлено продуктовой командой Medicare Vet на основе данных производителя, рекомендаций WOAH и опубликованных валидационных исследований. Не заменяет ветеринарную или лабораторную консультацию на вашем рынке.