qPCR liofilizada versus PCR con reactivos húmedos y LAMP para la detección de patógenos del camarón en la granja

Por qué los camarones son examinados, no tratados

Los crustáceos sólo tienen un sistema inmunológico innato: ni anticuerpos, ni memoria inmune, ni vacuna. Un estanque que sobrevivió a la mancha blanca el año pasado no está protegido este año. Por lo tanto, el control significa la exclusión de postlarvas, reproductores, alimento vivo y portadores infectados, y una detección temprana durante el cultivo, de modo que un resultado positivo desencadene una cosecha parcial o un cambio de manejo antes de que el estanque colapse. Cada una de esas decisiones es una prueba molecular, y la mayoría de ellas deben tomarse donde no hay laboratorio.

Cuatro métodos moleculares comparados

PCR convencional y anidada. La referencia histórica para WSSV, IHHNV y EHP. Dos rondas de amplificación y un gel dan una sensibilidad muy alta, pero la segunda ronda con tubo abierto es la fuente clásica de contaminación de amplicones, la ejecución dura de tres a cuatro horas, el resultado es una banda leída a ojo y requiere un laboratorio adecuado con salas separadas.

PCR en tiempo real (cuantitativa). Detección de fluorescencia con tubo cerrado, resultado en aproximadamente una hora y valor de umbral del ciclo que refleja la carga de patógenos. La carga importa en el camarón: un positivo débil en un estanque de engorde y un positivo fuerte en un lote de postlarvas requieren acciones diferentes. WOAH enumera la PCR en tiempo real junto con la PCR anidada como método recomendado para los principales virus del camarón.

LAMP y otras químicas isotérmicas. Calentamiento rápido y sencillo, lectura visual. Es atractivo para uso en el campo, pero el diseño de cebadores para LAMP de seis cebadores es difícil, la multiplexación es limitada y el alto rendimiento de amplicones hace que la contaminación por arrastre sea un riesgo persistente en un entorno agrícola. Se utiliza mejor como pantalla de un solo objetivo con una estricta separación física de pasos.

PCR en tiempo real liofilizada (criodesecada). La misma química que la qPCR con reactivos húmedos, con la mezcla maestra, los cebadores y la sonda secos en el tubo. El operador añade el extracto y el agua, y el tubo va directamente al analizador. Elimina en un solo paso el pipeteo de enzimas y la mayoría de las ocasiones de contaminación.

¿Qué cambia la liofilización?

Cadena de frío. Una mezcla maestra líquida debe mantenerse congelada desde la fábrica hasta la mesa de trabajo y solo tolera unos pocos ciclos de congelación y descongelación. Una granja a tres horas del congelador más cercano, o un criadero que sufre cortes de electricidad cada semana, no puede conservarla. En el caso de un kit liofilizado, compare la temperatura de conservación y la vida útil impresas en la etiqueta y en el prospecto con las condiciones del lugar; enviamos el prospecto junto con la cotización.

Pasos prácticos. Con reactivos húmedos, el operador pipetea el tampón, la enzima, los cebadores, la sonda y la plantilla en cada tubo; cada traslado es una oportunidad de contaminación y un requisito de capacitación. Con el tubo seco se hacen dos adiciones, extracto y agua. Por este motivo, un técnico de planta de incubación con un día de formación lo maneja de forma fiable.

Consistencia. Cada tubo de un lote lleva la misma masa de reactivo; no hay variación de pipeteo entre experimentos u operadores, lo que hace que los valores de Ct sean comparables de una semana a otra en el mismo estanque.

Sensibilidad. La química liofilizada correctamente formulada coincide con su equivalente húmedo; la liofilización protege la enzima en lugar de degradarla. Los límites de detección para la línea de acuicultura se indican por kit en las páginas del producto.

Un plan de muestreo que significa algo

Una prueba negativa en diez camarones dice poco sobre un estanque de un millón. Las tablas de muestreo de la WOAH dan el número de animales necesarios para detectar un patógeno con una prevalencia determinada con un 95 por ciento de confianza en una población grande: 150 animales para una prevalencia del 2 por ciento, 60 para un 5 por ciento, 30 para un 10 por ciento. Las postlarvas se combinan, por lo que una prueba de certificación en un lote suele ser una muestra combinada de 150 animales, a veces dividida en varios grupos para poder localizar un resultado positivo.

Durante el cultivo, un mínimo práctico es una muestra combinada de 10 a 20 camarones de la bandeja de alimentación cada dos o tres semanas, más sedimento del área de alimentación entre cultivos. Los reproductores se analizan de forma no letal a partir de heces o biopsia de pleópodos; Los alimentos vivos, como los poliquetos, se prueban por lotes antes de ingresar al criadero.

El flujo de trabajo de la granja, desde la muestra hasta la decisión

Recolectar: postlarvas, tejido, branquias, hepatopáncreas, heces, alimento o agua, en el estanque o en el criadero. Preparar: tampón sin extracción para tejido en cinco minutos, o el kit de perlas magnéticas para agua, sedimento y lotes. Analizar: rehidratar el tubo liofilizado con el extracto y cargar el analizador compacto; con el tampón sin extracción y los kits de 24 pruebas, el resultado y su valor Ct aparecen en pantalla unos 50 minutos después del muestreo. Decidir: rechazar o aceptar el lote, suspender o continuar el alimento vivo, cosechar antes de tiempo o completar el ciclo. Todo el circuito se cierra en una tarde, in situ: esa es la diferencia entre un programa de cribado que funciona y uno que solo existe en el papel.

Costo, en las únicas unidades que importan

Una prueba cuesta unos pocos dólares en reactivos y una hora de tiempo de un técnico. Una cosecha perdida cuesta la población, el alimento, la energía y la temporada. Un criadero que certifica cada lote mediante qPCR vende postlarvas a un precio superior y mantiene a sus clientes; una granja que realiza pruebas de detección en el momento de la siembra y cada dos semanas convierte un brote de WSSV de una pérdida total a una cosecha temprana parcial. La comparación entre los métodos anteriores es real, pero la comparación entre probar y no probar es la que decide si la granja seguirá allí el próximo año.

Escrito por el equipo de producto Medicare Vet a partir de datos del fabricante, orientación WOAH y validación publicada. No sustituye el asesoramiento veterinario o de laboratorio en su mercado.